CRM系統(tǒng)：白喉毒素?zé)o毒變異體CRM197 的表達(dá)及其載體作用
白喉毒素?zé)o毒變異體CRM197 的表達(dá)及其載體作用
王春娥葉強(qiáng)李鳳祥
【摘要】目的表達(dá)白喉毒素?zé)o毒變異體CRM197, 并考察其載體作用。方法利用基因工程技術(shù)在大腸桿菌BL21
( DE3) 中表達(dá)CRM197, 用金屬鎳離子親和層析純化; 以重組CRM197 為蛋白載體, 在EDAC 的作用下, 與活化的A 群腦膜炎球菌
莢膜多糖( GAMP) 結(jié)合, 制備GAMP-rCRM197 結(jié)合物, 免疫BALB / c 小鼠, 間接ELISA 法測定血清中A 群腦膜炎球菌多糖特異
性IgG 抗體, 并分析其免疫原性。結(jié)果重組CRM197 在大腸桿菌中主要以包涵體形式表達(dá), 表達(dá)量占菌體總蛋白的25%左右;
Western blot 證明重組CRM197 具有良好的反應(yīng)原性; 各針接種后, 結(jié)合物誘生的多糖特異性IgG 水平均顯著高于GAMP 組和
GAMP + rCRM197 混合物組, 具有較強(qiáng)的免疫原性; 多次接種產(chǎn)生了免疫增強(qiáng)效應(yīng), 重組CRM197 具有載體蛋白的作用。結(jié)論已
在大腸桿菌BL21( DE3) 中成功表達(dá)了重組CRM197, 以純化的重組CRM197 作為載體制備的GAMP-rCRM197 結(jié)合物具有良好的免
疫原性, 為以重組CRM197 為蛋白載體制備其他結(jié)合疫苗奠定了實驗基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】白喉毒素; 無毒變異體; CRM197; 載體蛋白; 結(jié)合疫苗; A 群腦膜炎球菌
Expr ession of Nontoxic Diphther ia Toxin Mutant CRM197 as A Car r ier Protein
WANG Chun-e, YE Qiang, LI Feng-xiang ( National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological
Products, Beijing 100050, China)
【Abstr act】Objective To express the nontoxic mutant CRM197 of diphtheria toxin and study its effect as a carrier protein.
Methods Express CRM197 in E. coli BL21 ( DE3) by gene engineering technique and purify the expressed product by nickel ion
affinity chromatography. Link the purified CRM197 as a carrier protein to activated group A meningococcal polysaccharide( GAMP) ,
using EDAC as linker. Immunize BALB / c mice with the prepared GAMP- CRM197 conjugate and determine the specific IgG against
GAMP in sera by indirect ELISA. Results Recombinant CRM197 was expressed in E. coli mainly in a form of inclusion body. The
expressed product contained about 25% of total somatic protein and showed good reactogenicity as proved by Western blot. The IgG
level against GAMP induced by GAMP- CRM197 conjugate was significantly higher than those by GAMP and by the mixture of GAMP
and rCRM197. Repeated immunization with the conjugate induced immunopotentiation, indicating the effect of CRM197 as a carrier protein.
Conclusion Recombinant CRM197 was successfully expressed in E. coli, and the GAMP-rCRM197 conjugate prepared with the
purified expressed product showed good immunogenicity. It laid an experimental foundation of preparation of other conjugate vaccine
using CRM197 as a carrier protein.
【Key words】Diphtheria toxin; Nontoxic mutant; CRM197; Carrier protein; Conjugate vaccine; Group A meningococcus
國際上應(yīng)用的載體蛋白主要有4 種: 破傷風(fēng)類
毒素、白喉類毒素、白喉毒素的無毒變異體CRM197
和B 群腦膜炎球菌外膜蛋白復(fù)合體。而國內(nèi)研制的
結(jié)合疫苗多采用破傷風(fēng)類毒素[ 1～3 ] , 此類結(jié)合疫苗
雖然具有較好的免疫效果, 但破傷風(fēng)毒素相對分子
質(zhì)量較大, 致敏性較強(qiáng), 且存在毒性回復(fù)的危險。使
用無毒性的蛋白十分有必要。CRM197 為白喉毒素的
無毒變異體, 經(jīng)研究證明其免疫原性與白喉毒素幾
乎無差別[ 4, 5 ] , 作為載體蛋白在國外已得到廣泛應(yīng)
用[ 6~8] 。目前, 國內(nèi)尚未見以CRM197 為載體的結(jié)合疫
苗研制的報道。本研究根據(jù)國內(nèi)外CRM197 的研究情
況及國內(nèi)腦膜炎球菌結(jié)合疫苗的研制現(xiàn)狀, 采用基
因工程技術(shù)在大腸桿菌中表達(dá)crm197 基因, 并對表
達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化, 以其作為蛋白載體, 制備了A 群腦
膜炎球菌結(jié)合物, 并初步研究了結(jié)合物的免疫原性。
1. 材料與方法
1. 1 菌株及質(zhì)粒
白喉棒狀桿菌C7( β197) 菌株( ATCC53281) 購自
ATCC; pCR 2.1-TOPO 質(zhì)粒和感受態(tài)大腸桿菌TOPO10
購自Invitrogen 公司; 質(zhì)粒pET-28a 和大腸桿菌BL21
( DE3) 由本室保存。
1. 2 試劑
Ex Taq 酶、DNA marker 和凝膠回收試劑盒均購
自寶生物工程( 大連) 有限公司; 質(zhì)粒小量提取試劑
盒購自上海華舜公司; 限制性內(nèi)切酶購自紐英倫生
物技術(shù)( 北京) 有限公司; 蛋白質(zhì)低相對分子質(zhì)量標(biāo)
準(zhǔn)購自BIO-RAD 公司; Chelating SepharoseTM Fast
Flow 和Sepharose 4 Fast Flow 購自GE Healthcare;
HRP 標(biāo)記的兔抗馬IgG 購自北京欣經(jīng)科公司; 白喉
絮狀反應(yīng)抗毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品( 1000Lf) 由本所血清室
提供, 批號0048; A 群腦膜炎球菌莢膜多糖( GAMP) ,
批號20050201, 由云南沃森生物技術(shù)有限公司提供;
A群流腦診斷血清國家參考品, 批號2003, 效價1∶320,
由本室保存; CRM197 陽性對照( 1 mg) 、溴化氰( CNBr) 、
1, 6-己二酰肼( ADH) 、碳二亞胺( EDAC) 和2, 4, 6-三
硝基苯磺酸( TNBS) 均購自Sigma Aldrich 公司; 辣根
過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 為北京中杉金橋生
物技術(shù)有限公司原裝進(jìn)口分裝產(chǎn)品。
1. 3 實驗動物
SPF 級BALB / c 小鼠, 體重18 ~ 20 g, 雄性, 由
本所實驗動物中心提供。
1. 4 PCR 引物設(shè)計及合成
參考GenBank 中白喉毒素的編碼基因序列( 收
錄號為K01722) [ 9] , 用引物設(shè)計軟件Oligo 6. 0 設(shè)計
引物, 由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
引物序列如下: 上游: 5′-CGCATATGGGCGCTGATG
ATGTTGTT- 3′( 引入NdeⅠ酶切位點) ; 下游: 5′-AT
GGATCCCGACCCCACTACCTTTCC-3′( 引入BamHⅠ
酶切位點) 。
1. 5 目的基因的擴(kuò)增及克隆
提取白喉棒狀桿菌C7( β197) 基因組DNA 作為
模板, 擴(kuò)增目的基因。反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性5min;
94℃ 30 s, 55℃ 退火1 min, 72℃ 延伸1. 5 min, 共30
個循環(huán); 最后72℃延伸10 min。1% 瓊脂糖凝膠電泳
分析擴(kuò)增片段的大小, 凝膠回收試劑盒回收目的片
段, 連接于pCR 2. 1-TOPO 載體, 轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿
菌TOP10, 挑選陽性克隆, 提取質(zhì)粒, 經(jīng)NdeⅠ 和
BamHⅠ雙酶切鑒定后, 將陽性克隆送上海生工生物
工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定。
1. 6 重組表達(dá)載體的構(gòu)建
將測序正確的陽性克隆提取質(zhì)粒, 與pET-28a
質(zhì)粒分別用NdeⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切, 凝膠回
收相應(yīng)片段, 連接后, 轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21( DE3) ,
篩選陽性克隆, 提取質(zhì)粒, 進(jìn)行雙酶切鑒定。
1. 7 重組CRM197 的誘導(dǎo)表達(dá)
將含有陽性重組質(zhì)粒的大腸桿菌, 在37℃,
0. 2 mmol /L IPTG 的條件下誘導(dǎo)表達(dá)4 h, 離心收集
菌體, 超聲破碎, 分析重組CRM197 表達(dá)形式。
1. 8 重組CRM197 的純化
將包涵體分別用含1% Triton X-100 的Tris 緩
沖液( pH 8. 5) 和含2 mol / L 尿素的PBS 緩沖液
( pH 7. 4) 洗滌, 進(jìn)行初步純化, 最后將包涵體沉淀用
含35 mmol / L 咪唑和8 mol / L 尿素的緩沖液溶解,
4℃, 12 000 r /min 離心20 min, 取上清, 加樣于金屬
螯合親和層析柱, 用含250 mmol /L 咪唑的緩沖液洗
脫。收集洗脫液, 進(jìn)行SDS-PAGE 分析, 凝膠成像分
析蛋白純度。將純化后的重組蛋白以梯度透析法除
去尿素和咪唑。
1. 9 重組CRM197 的鑒定
將純化后的重組CRM197 和陰性對照樣品[ pET-
28a /BL21( DE3) ] 經(jīng)SDS-PAGE 后, 用半干膠轉(zhuǎn)移儀
轉(zhuǎn)移至PVDF 膜, 以白喉抗毒素( 馬血清) 為一抗,
HRP 標(biāo)記的兔抗馬IgG 為二抗, 進(jìn)行Western blot 檢
測。
1. 10 GAMP-重組CRM197 結(jié)合物的制備
參考文獻(xiàn)[ 1~3, 10] 進(jìn)行。將GAMP( 6 mg /ml) 用
0. 1 mol /LNaOH 調(diào)pH 至10. 5 ±0. 2; 以0. 5 mg /mg
GAMP 的比例緩慢加入CNBr, 并使pH 穩(wěn)定在10. 5 ±
0. 2, 室溫攪拌反應(yīng)6 min; 加入與多糖等體積的
0. 5 mol / L ADH ( 預(yù)先溶解于0. 5 mol / L NaHCO3
中) , 用0.1mol/LHCl 調(diào)整pH 穩(wěn)定在8.5 ±0.2, 室溫攪
拌反應(yīng)20 min; 反應(yīng)體系于3 ～8℃攪拌反應(yīng)12 h 以
上后, 透析除去游離的CNBr 和ADH, 測定衍生物的
ADH 及O-乙酰基含量。
將衍生物與等量重組CRM197 混合, 用0. 1 mol /L
HCl 調(diào)整pH 為6. 0 ～6. 2, 加入EDAC 粉末至終濃度
為0. 1 mol / L, 并維持pH 為6. 0 ～6. 2, 室溫攪拌反
應(yīng)2 h; Sepharose 4 Fast Flow( XK 1. 6 cm ×90 cm) 層
析柱進(jìn)行凝膠過濾純化, 同時監(jiān)測206 nm、280 nm
波長處的吸光度值。
1. 11 結(jié)合物的檢測
1. 11. 1 生化檢測: ADH 含量測定采用TNBS 法; O-
乙酰基含量測定采用Herstrin 法; 蛋白質(zhì)含量測定
采用Lowry 法; 磷含量測定采用改良Chen 法; EDAC
殘留量按常規(guī)方法進(jìn)行。
1. 11. 2 抗原性檢測: 采用免疫雙擴(kuò)散法, 按照《中
國藥典》三部( 2005 版) 方法進(jìn)行。
1. 11. 3 免疫原性檢測: 將144 只雄性BALB / c 小
鼠隨機(jī)分為4 組, 每組36 只, 分別為:A 組:GAMP 組;
B 組: GAMP + rCRM197 混合物組; C 組: GAMPrCRM
197 結(jié)合物組; D 組: 生理鹽水對照組。
皮下接種, 劑量為0. 2 ml / 只, 前3 組分別含多
糖2. 5 μg, 于第0、14、28 天接種, 第14、28、35 天眼
眶采血。離心收集血清, 用間接ELISA 方法測定血
清中多糖特異性IgG 抗體。以陰性對照血清平均吸
光度值的2. 1 倍作為Cutoff 值, 以吸光度> Cutoff
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